Pemimpin klasemen Martin memperoleh sedikit peningkatan di sore hari dan berakhir di posisi keenam, hanya unggul 0,019 detik dari rival Gresini dan pemenang San Marino Marc Marquez.
Marquez adalah salah satu pembalap terakhir yang keluar dari pitlane di pagi hari, hanya menyelesaikan 19 putaran di sesi pertama sebelum menambah 29 putaran lagi di putaran kedua hari itu.
Marco Bezzecchi berada di posisi kedelapan untuk VR46 di depan Aprilia teratas Maverick Vinales, yang mengalami kecelakaan kecil di pagi hari di Tikungan 13.
10 besar diselesaikan oleh Raul Fernandez dari Trackhouse Racing.
Seperti Yamaha, Honda juga agresif dengan pendekatan pengembangannya di Misano karena secara bersamaan menguji sejumlah besar motor yang dibuat dengan spesifikasi berbeda, Pembalap pabrikan Joan Mir sendiri memiliki tiga motor berbeda untuk dikendarai di garasi HRC miliknya.
Akhirnya, pembalap LCR Johann Zarco menjadi pembalap tercepat dari kontingen Jepang di posisi ke-18, tertinggal 1,365 detik, dengan rekan setimnya Takaaki Nakagami finis tepat di belakangnya di posisi ke-19.
Baik Luca Marini maupun juara 2020 Mir dapat mengikuti tes setelah absen di balapan Misano karena cedera, masing-masing finis di posisi ke-21 dan ke-22.
Honda melaporkan bahwa "kedua pembalap [merasa] baik-baik saja dengan kondisi fisik mereka setelah putaran pertama" saat mereka terus mengumpulkan data pada RC213V mereka.
Semua pembalap diizinkan untuk menguji konstruksi ban depan baru yang dibawa oleh Michelin, sebelum menyampaikan umpan balik mereka kepada pabrikan Prancis tersebut.